自旋捕獲電子順磁共振方法在研究反應(yīng)活性中間體中已得到廣泛應(yīng)用，并發(fā)展為一種可靠的實(shí)驗(yàn)方法。對(duì)于生物體系中的低濃度、短壽命自由基，自旋捕獲技術(shù)結(jié)合電子順磁共振技術(shù)，在常溫下便可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于不同的自由基，其與捕獲劑加合反應(yīng)后形成的加成物的EPR譜圖不同，可以根據(jù)EPR譜圖結(jié)果反推出自由基的種類，對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。本文以DMPO為例，給大家簡(jiǎn)單介紹下DMPO捕獲自由基的簡(jiǎn)單譜圖分析。 DMPO捕獲譜圖基本原理 使用DMPO作為自旋捕獲劑時(shí)，自由基會(huì)加成到DMPO中Cα=N上的Cα上，由于電子和核的超精細(xì)相互作用，氮和氫核會(huì)使EPR譜圖由單一的峰裂分為多個(gè)峰。對(duì)于不同的自由基，形成的自旋捕獲加成物中氮核、氫核等磁性核與電子的超精細(xì)相互作用不同，會(huì)導(dǎo)致EPR譜圖不同，因此可根據(jù)EPR譜圖結(jié)果提供所捕獲的自由基的信息。 圖1 DMPO捕獲自由基原理 DMPO捕獲自由基EPR譜圖解析 當(dāng)我們采集到一張自旋捕獲EPR譜圖時(shí)，可通過(guò)四步方法來(lái)確定測(cè)試的自由基種類。 （1）確定信號(hào)出峰范圍 對(duì)于DMPO捕獲自由基形成的加成物，其EPR譜圖出峰的范圍通常為2AN+AHβ+AHγ，一般AHγ?AHβ。以DMPO捕獲?OOH為例，AN、AHβ、AHγ如圖2所示。根據(jù)較低場(chǎng)與較高場(chǎng)超精細(xì)分裂峰的間隔，可初步判斷自由基種類。如對(duì)于飽和烷基，2AN+AHβ約為52 G；不飽和烷基，2AN+AHβ大于56 G；烷氧自由基，2AN+AHβ小于35 G；羥基自由基，2AN+AHβ約為45 G；超氧陰離子、過(guò)氧和烷過(guò)氧自由基，2AN+AHβ約為38 G。具體數(shù)值可參照蘇吉虎老師著作《電子順磁共振波譜：原理和應(yīng)用》。 圖2 DMPO捕獲?OOH的EPR譜圖 （2）確定峰的個(gè)數(shù)與強(qiáng)度 對(duì)于不同的自由基，被DMPO捕獲后形成的加成物的峰的個(gè)數(shù)與強(qiáng)度會(huì)有所差別。可根據(jù)峰的個(gè)數(shù)與強(qiáng)度進(jìn)行初步判斷。比如DMPO捕獲羥基自由基后形成的加成物的EPR譜圖有四條峰組成。這主要是因?yàn)閷?duì)于DMPO-*OH，AN≈AHβ，所以四條峰強(qiáng)度比為1：2：2：1，如圖3所示。 圖3 DMPO-*OH的EPR譜圖 （數(shù)據(jù)由國(guó)儀量子EPR系列產(chǎn)品測(cè)試所得） （3）判斷AHβ大小 對(duì)于具有相同信號(hào)峰個(gè)數(shù)的EPR譜圖，可根據(jù)AHβ的大小進(jìn)行分辨。例如烷氧自由基與超氧陰離子自由基，兩者的EPR譜圖均為6個(gè)峰，譜圖較為相似，常會(huì)被混淆。 在超氧自由基捕獲實(shí)驗(yàn)中，通常將烷氧自由基歸屬于超氧陰離子。那么如何判斷捕獲到的自由基是烷氧自由基還是超氧陰離子呢？此時(shí)可通過(guò)EPR譜圖AHβ的大小來(lái)進(jìn)行判斷。 對(duì)于烷氧自由基，AHβ=7~8 G，對(duì)于超氧陰離子，其AHβ=9~12 G，如圖4所示，且烷氧自由基的超精細(xì)分裂峰普通比較寬，且形成重疊，即使降低調(diào)制幅度也無(wú)法作去卷曲處理。其他類型自由基的超精細(xì)分裂峰的峰-谷間隔都比較小，不易發(fā)生重疊。 圖4 DMPO捕獲烷氧自由基與超氧陰離子的EPR譜圖對(duì)比 （4）加入清除劑進(jìn)行二次驗(yàn)證 對(duì)于羥基自由基、超氧陰離子等可通過(guò)加入清除劑，看信號(hào)是否減弱進(jìn)行二次驗(yàn)證。例如，對(duì)于羥基自由基，可加入甲醇、乙醇、DMSO等進(jìn)行二次驗(yàn)證。對(duì)于超氧陰離子自由基，可通過(guò)加入超氧化物歧化酶（SOD）進(jìn)行二次驗(yàn)證。 圖5 使用乙醇清除?OH進(jìn)行二次驗(yàn)證 （數(shù)據(jù)由國(guó)儀量子EPR系列產(chǎn)品測(cè)試所得）